本文目录
- 雷帕霉素的作用机理
- 细胞自噬
- 细胞自噬 与细胞活性之间的关系
- 细胞自噬研究策略
- 科学家构建靶向治疗缺血型脑卒中胶束递药系统
- GM1神经节苷脂抗帕金森病的新机制:自噬依赖性去除α-突触核蛋白
- 安卓健和物罗凯的药理作用机制有何区别
- 雷帕霉素mTOR 抑制剂浓度
雷帕霉素的作用机理
雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，雷帕霉素可阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和非钙依赖性的信号传导通路。雷帕霉素和FK506一样，结合在相同的免疫亲和蛋白（immunophilin）FKBP12上，形成RAPA-FKBP12复合物，这种复合物不能与钙调素结合，并且雷帕霉素亦不抑制T细胞的早期激活或直接减少细胞因子的合成。这种复合物的靶蛋白最早是在酵母菌中被确定，称为TOR1和TOR2。
最新研究发现，雷帕霉素（rapamycin）是一种有效的自噬诱导剂 ，通过诱导自噬从而减轻炎症反应，可能是其发挥免疫抑制的机制之一。
细胞自噬
自噬（autophagy）被认为是维持细胞稳态的关键过程，也是对等压力源的反应，如营养缺乏，这可能会危及细胞的生存。当细胞接触到这些压力源时，原本在低水平发生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就会被大幅度上调。 这种上调会增加了细胞的吸收和降解，将大分子释放回胞质中以驱动必须的代谢反应并产生能量。
在正常和压力条件下，自噬对细胞健康的贡献，意味着这种严格调控和精确协调过程的重要生理和病理作用。事实上， 自噬在哺乳动物的发育过程中被发现是有用的。 此外，最近的研究发现自噬是各种疾病和病症的重要调节器。探索自噬在发育和疾病中的参与，对于更全面地了解这一途径的作用至关重要，并且可能对保持健康或治疗疾病有影响。
自噬的研究已经成为如今医学研究的常客，发文量也十分巨大，成为常规生物学现象来研究，但是有一些实验上的技巧值得探讨一二，例如一些试剂的使用等等
1、自噬相关试剂的使用。
①MDC: 取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;
②Rapamycin: 用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;
400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积《0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;
③3-MA: 首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L;PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成；
用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主
④Earle’s balanced salts solution (EBSS) for 48 h
sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些
⑤无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了。
⑥Hank’s诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank’s替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank’s诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
⑦sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存
不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。
⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。
1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol；
2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。
2、自噬诱导剂
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的药物有：
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
(3) Earle’s平衡盐溶液：制造饥饿
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
(5) Rapamycin：mTOR抑制剂
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
3、自噬抑制剂
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂
(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:T7765 ;溶于DMSO中配成储存液,使用时DMSO终体积浓度不超过1/1000。
3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:M9281;溶于灭菌超纯水制成储存液。
氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司产品,货号:C6628;溶于灭菌超纯水中制成存液。
雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司产品,货号:R8781;
4、MDC染色焚光显微镜检测细胞自睡
单丹黄酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一种突光染料,被用作自吞泡的示踪剂。具体操作步骤如下:
(1)将处于对数生长期的HepG2细胞按常规方法消化后接种于6孔板,每孔接种1x106个细胞;
(2)细胞密度达到60%-70%时,弃去培养液,小心用PBS洗1遍,分别用含TG浓度为0、0.5、1 nM的培养基及含Rapamycin (终浓度1 pM)的培养基继续培养24 h;
(3)弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(终浓度50 nM)的培养基于37 V、5% CCh的恒温培养箱中避光温育20 min;
(4)取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。
5、流式细胞术检测细胞自噬发生率
(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和0.5uM的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,将上清收集到4 ml的离心管中;
(2)每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5%0?的恒温培养箱中避光孵育30 min;
(3)将收集的上清2000rpm,离心5min;
(4)弃掉上清,每管加入500ul含MDC(终浓度50 uM)的MEM培养基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;
(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混匀收集到1.5ml的离心管中,2000 rpm.离心5 min;
(6)弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000rpm,离心5 min;
(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;
(8)鲜育完的上清,2000rpm,离心5 min;
(9)弃掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的离心管中,2000 rpm,离心5 min;
(10)重复步骤(6)和(7);
(11)将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。流式细胞
仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。
LC3B WB: 1:2000
条件是15% SDS-PAGE, 正常跑胶至下沿0.5cm即可，200mA 湿转45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封闭1h，4C过夜摇动孵育，洗抗体3*5min即可
LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min
转自科研者言公众号
基金知识##细胞自噬的相关实验和方法，对实验很有用
细胞自噬 与细胞活性之间的关系
细胞自噬是指在自噬相关基因的调控下，利用溶酶体降解自身受损的细胞器及大分子物质的过程，以此维持细胞自身的需要及细胞器的更新。
一、细胞自噬的基本概念及特征
1、自噬的过程
细胞质中的线粒体等细胞器首先被称为“隔离膜”的囊泡所包被,这种“隔离膜”主要来自于内质网和高尔基体;囊泡逐渐闭合最终形成双层膜结构,即自噬体，其大小约为 500 nm左右，囊泡内常见的包含物有胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等;自噬体的外膜与溶酶体融合形成降解自体吞噬泡；由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。
2、自噬的形态学变化
在电镜下能观察到高尔基体等细胞器膨胀，细胞核固缩，形成大量的吞噬泡，细胞质膜发生特化。
3、自噬的分类
①巨自噬（Macroautophagy）：最为常见，即上面说的自噬过程。
②微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式。
③分子伴侣介导的自噬（CMA）：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
4、影响因素
其影响因素包括：饥饿、蛋白聚集、凋亡、缺氧、病原体感染等，均会造成细胞自噬产生。正常情况下，细胞自噬发生的概率很低，只有受到以上因素的影响时，自噬才会被激活，参与机体稳态调控。
二、细胞自噬信号通路
自噬的调控
1、依赖mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）途径的自噬
1）PI3K-AKT-mTOR信号通路
2）AMPK-TSC1/2-mTOR 信号通路
2、其它的信号通路
1）3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制Class ⅢPI3K的活性抑制自噬。
2）beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成Class ⅢPI3复合物调控自噬。
3）GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬。
4）死亡相关蛋白激酶（death-associated protein linase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）诱导自噬。
三、细胞自噬的研究方法
1、自噬体的观察
直接法：直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化
① 初期，主要特征是成新月状，单层或多层膜
② 中期：双层或多层的液泡状结构即自噬体结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网等
③ 后期：形成自噬溶酶体，单层膜，胞浆成分已降解。
间接法：
① RFP-GFP-LC3双荧光标记
② GFP-LC3单荧光标记
③ MDC染色
2、自噬相关蛋白的研究
通过Western Blot检测LC3II/I，p62，Beclin-1，ULK1蛋白的表达量
四、自噬研究进展
（1）细胞自噬与神经退行性疾病
Yan Yin ，etal，Ageing Research Reviews，2017
Yan Yin等人研究发现，在神经退行性疾病例如阿尔茨海默病中，β-淀粉样蛋白在脑部的沉积可以抑制自噬体和溶酶体的融合，从而抑制自噬，导致神经细胞的死亡。
（2）细胞自噬与中药靶点研究
Bing Cui，etal，Asian Natural products Research，2017
Bing Cui，etal，Asian Natural products Research，2017
Bing Cui等人研究了多种中药成分在自噬调控中的作用，发现黄连素通过AMPK，抑制mTOR，进而促进细胞自噬；黄酮类药物主要与癌症相关，通过激活Beclin1，促进细胞自噬；多酚类药物在心血管疾病中应用较多，通过P38和LC3等靶点促进细胞自噬。
（3）细胞自噬与病原体感染
Yan Zhou，etal，Bbadis，2017
Yan Zhou，etal，Bbadis，2017
Yan Zhou等人研究发现，轮状病毒RV NSP4抑制IGF受体，阻断其与PI3K的结合，抑制了下游mTOR信号通路，解除了对ULK1的抑制作用，从而促进自噬，为病毒在宿主体内增殖提供条件。
（4）细胞自噬与免疫
SamuelD Dowling，etal，Cancer Lett，2018
T细胞的激活与TCR信号通路和CD28信号通路有关，TCR信号通路和CD28信号通路的激活能促进IL-2的转录表达，IL-2与其受体结合，激活自噬相关通路，可以将错误折叠的蛋白和一些细胞器降解，为细胞生存提供条件。
（5）细胞自噬与肿瘤
细胞自噬与肿瘤的关系较为复杂，一方面，正常细胞自噬增强，可表现出抑制肿瘤发生的功能；另一方面，肿瘤细胞也可通过增强细胞自噬来对抗由缺氧、代谢产物、治疗药物诱导的应激反应。
细胞自噬研究策略
医学科研实验基础知识笔记（四）：细胞自噬研究策略
细胞自噬是指细胞在外界环境因素的影响下， 细胞利用溶酶体降解自身受损、 变性或衰老的大分子物质以及细胞器的自我消化过程。自噬是细胞的一种自我保护机制， 广泛存在于真核细胞内， 在调节细胞生存和死亡的过程中， 起着重要的作用。
当细胞发生自噬后， 在自噬相关基因的调节下， 细胞通过单层或双层膜， 包裹待降解的细胞质或细胞器， 形成囊泡状的自噬体（autophagosome） 。然后自噬体再和溶酶体（lysosome）
发生融合形成自噬溶酶体（autolysosome） ， 由溶酶体内的一系列水解酶， 降解自噬溶酶体内所包裹的内容物， 以实现细胞对自身代谢和能量的更新。
1.自噬的细胞学分类及过程
根据细胞内物质运输到溶酶体的方式以及生理功能的差异， 哺乳动物的细胞自噬可以分为三种类型：大自噬/宏自噬（macroautophagy） ， 小自噬/微自噬（microautophagy） 和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA） 。
1） 大自噬/宏自噬：我们通常所说的自噬指的就是大自噬/宏自噬。在大自噬的过程中， 细胞质中可溶性的大分子物质以及变性的细胞器， 被内质网、 线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体。接着自噬体的外膜与溶酶体膜融合， 进一步形成自噬溶酶体， 自噬体内的待降解物被一系列的水解酶降解， 最终完成整个的自噬过程。
2） 小自噬/微自噬：与大自噬过程不同， 是溶酶体膜自身发生内陷， 包裹和吞噬细胞内待降解的底物， 并在溶酶体内发生降解。小自噬与大自噬的区别就在于， 在小自噬过程中胞质成份是直接被溶酶体包裹， 没有形成自噬体的过程。
3） 分子伴侣介导的自噬：在分子伴侣介导发生的自噬过程中， 其待降解的底物都是可溶性的蛋白质分子。分子伴侣蛋白识别带有特定氨基酸序列的底物蛋白质分子， 并与之结合， 然后再经溶酶体膜上的受体 Lamp2a（lysosome-associated membrane protein 2， Lamp2） 转运到溶酶体；底物蛋白分子再在溶酶体内， 被水解酶降解。因此， 分子伴侣介导的自噬与前两者不同， 在降解蛋白时具有选择性。而大自噬和小自噬现象中， 一般而言， 在降解蛋白时没有明显的选择性。
2.自噬信号通路
3.自噬与凋亡的关系
细胞凋亡也被称为 I 型程序性细胞死亡；自噬则被称为 II 型程序性细胞死亡。凋亡和自噬是两种显著不同的细胞死亡形式， 两者在形态、 生化指标以及调控细胞死亡的过程上都存在着较大的差异， 但两者又不是两个完全独立的过程。许多研究表明， 凋亡和自噬的作用以及功能在某些情况下也是相互影响和制约的。自噬和凋亡之间存在着三种不同类型的相互作用，而且每种类型都对应着相应的特定的细胞类型、 刺激和环境。
1） 自噬和凋亡互相协同， 共同促进细胞死亡。两种效应之间， 可以其中一种效应影响另一种效应；自噬也可以作为凋亡的上游调节因子， 直接调控细胞凋亡， 从而影响细胞的死亡；
2） 自噬可以通过促进细胞存活而拮抗细胞的凋亡效应。比如， 可以通过去除因氧化应激受损的细胞器， 或降解变性的大分子物质， 为饥饿的细胞提供生存所需要的营养和能量；或者通过降解未折叠的蛋白来抑制内质网应激。自噬的这些功能将会抑制促凋亡信号的产生， 从而起到拮抗细胞凋亡的作用。
3） 自噬有时虽然自身并没有导致细胞死亡， 但却参与了细胞凋亡的过程。比如自噬参与了一些 ATP 依赖的凋亡过程。
4.自噬的分子机制和特征
1） 自噬诱导阶段（induction） ：正常生理状态下， 细胞保持很低的基础自噬水平。这时细胞内能量充足，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 1(也就是 mTOR 复合物 1，也叫做 mTORC1)处于活化的状态。活化的 mTORC1 通过磷酸化的方式使得 ATG13 发生磷酸化反应， 从而抑制细胞的自噬。
2） 成核过程（vesicle nucleation） ：成核过程和 Vps34-ATG6 复合物密切相关。这个复合物还包含有调节性蛋白激酶 Vps15， 共同作用于膜泡的成核， 介导 PAS(也就是前自噬体结构pre-autophagosomal structure)的形成。
Vps34-ATG6 复合体还可以召集 ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚体以及 LC3， 并通过后两者促进吞噬泡的伸展扩张。请大家注意， Vps34 在哺乳动物中的同源蛋白是 class III PI3K；ATG6在哺乳动物中的同源蛋白是 Beclin-1， 所以 Vps34-ATG6 复合体， 也被称为 PI3K-Beclin-1复合物。
3） 自噬体的延伸阶段：这个过程的分子机制是最为复杂的。哺乳动物自噬体的延伸主要依赖于两个类泛素化的系统：a） ATG12 的结合过程；b） LC3 的修饰过程。
ATG12 的结合过程是类似泛素化的过程， 需泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。ATG12 首先由 E1样酶 ATG7 活化， 再通过 E2 样酶 ATG10 转运并结合 ATG5， 然后和 ATG16 结合， 生成ATG12-ATG5-ATG16 的多体复合物。这个复合物定位于前自噬体结构的外膜表面， 并参与前自噬体外膜的扩张。
LC3 在酵母中的同源基因是 ATG8。LC3 的修饰过程同样需要类似泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。LC3 前体形成后被 ATG4 加工成胞浆可溶性的 LC3-Ⅰ， 然后在 E1 样酶 ATG7 和 E2样酶 ATG3 的作用下， 和磷脂酰乙醇胺(PE)共价连接成为脂溶性的 LC3-PE（也就是 LC3-II），并参与膜的延伸。LC3-Ⅱ能够与新形成的膜结合， 直到自噬溶酶体(Autolysosome)的形成。因此， LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标识物， 也是一种重要的定位于自噬泡膜上的多信号传导调节蛋白。
哺乳动物的 ATG12-ATG5 类泛素化过程和 LC3 类泛素化过程并不是独立运行的， 它们之间可以相互作用、 相互调节。
4） 自噬体的成熟阶段：自噬体的成熟主要是指自噬体通过微管骨架在转运必须内吞体分类复合物(ESCRT)和单体 GTP 酶(Rab S)作用下， 与溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程。参与成熟阶段的溶酶体相关蛋白还包括：LAMP1、 LAMP2、 UVRAG(紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因)。
5） 自噬体的裂解阶段：是指自噬溶酶体膜的裂解及内容物在溶酶体水解酶的作用下降解的过程。降解过程中产生的氨基酸及部分蛋白可以为细胞提供营养、 能量或循环利用。
5.自噬诱导剂
a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
c) Earle’s平衡盐溶液：制造饥饿
d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
e) Rapamycin：mTOR抑制剂
f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
6.自噬抑制剂
a) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
c) Hydroxychloroquine（羟氯喹）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
7.自噬的检测手段
自噬的评估通常采用多个自噬阶段的标志物，因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段降解被抑制所致，所以设置合适的对照很有必要。
（1）透射电镜，电镜观察自噬体和溶酶体的超微结构；
（2）WB检测标志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1；生化检测自噬体膜标志蛋白， 特别是ATG12、 ATG5 和 LC3；荧光显微镜检测 LC3 或GFP-LC3 斑点的形成；生化检测自噬底物 p62。
（3）WB检测Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。
（4）组织蛋白酶Cathepsin活力检测。
（5）IF检测自噬潮autophagic flux
自噬过程进行观察和检测 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
（1）观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
（2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
（3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。需要多种检测方法结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）
（4）检测长寿蛋白的批量降解：非特异
（5）MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
（6）CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
自噬相关蛋白的定位 在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。
由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔
（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理。）
8.自噬研究常规思路
通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激，如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等，通常的研究模式：
（1）证明自噬参与了相关研究表型（电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等）
（2）证明自噬在表型中起到关键作用（通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究）找到表型与自噬桥梁分子（检测pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员）
（3）在基因层面通过gain of/lost of function研究桥梁分子在自噬中的作用。
9.研究自噬的文献参考
. Emerging Mechanisms in Initiating and Terminating Autophagy. Trends Biochem Sci. 2017 Jan;42(1):28-41.
. Targeting autophagy in cancer. Nat Rev Cancer. 2017 Sep;17(9):528-542.
. Autophagy: controlling cell fate in rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2016 Sep;12(9):517-31.
. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways: balancing defence and homeostasis. Nat Rev Immunol. 2016 Nov;16(11):661-675.
. Autophagy and Neurodegeneration: Pathogenic Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Neuron. 2017 Mar 8;93(5):1015-1034.
. Activating autophagy to potentiate immunogenic chemotherapy and radiation therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2017 Apr;14(4):247-258.
. Epigenetic Control of Autophagy: Nuclear Events Gain More Attention. Mol Cell.2017 Mar 2;65(5):781-785.
. Pharmacological modulation of autophagy: therapeutic potential and persisting obstacles. Nat Rev Drug Discov.2017 Jul;16(7):487-511.
科学家构建靶向治疗缺血型脑卒中胶束递药系统
脑卒中分为出血性和缺血性，其中缺血型是临床上主要的发病类型（占70%左右），目前作为金标准的溶栓治疗方案虽可以有效实现血管再通，并降低患者的死亡率，但由于存在再灌注损伤，患者在血管疏通后，往往会出现脑部损伤的进一步恶化，以及血流灌注受限的“无复流”的现象，使近半数的患者出现残疾，严重影响预后及生活质量。因此，亟待开发出一种可有效缓解脑卒中缺血再灌注损伤的治疗策略。
据蒋晨教授介绍，神经血管单元包括神经细胞、脑血管内皮细胞、小胶质细胞等多种脑内细胞类型，在脑卒中溶栓治疗时，再灌注损伤过程中，会引发包括氧化应激、神经炎症、血管损伤等多种病理机制的级联反应，使该结构中的多种细胞同时受到不良影响后发生代谢、表型以及功能异常而引起不可逆的脑部损伤。
为此，研究人员提出了以“神经血管单元”为基本结构的脑病理机制探究模式，并设计并构建了一种能够靶向治疗缺血病灶血管内微血栓的胶束递药系统，该系统装载着可调节细胞应激通路的药物雷帕霉素，实现了对 “神经血管单元”内多种细胞的同时调控。同时，该递药系统可以通过结合微血栓，进一步跨越受损血脑屏障而进入缺血病灶，在微环境中高水平的活性氧簇刺激下释放药物。其所载药物还可上调神经细胞自噬水平，对抗缺血应激状态、修复细胞。
专家表示，通过该递药系统与药物的联合作用，可达到对神经的有效保护和对小胶质细胞的有利调控，以及恢复血脑屏障功能的目的，进而成功重塑神经血管单元的生理功能，增强了微循环的血流灌注，并减小了脑部的梗死灶面积。（孙国根 黄辛）
相关论文信息：https://doi.org/10.1002/adma.201808361
GM1神经节苷脂抗帕金森病的新机制:自噬依赖性去除α-突触核蛋白
前言
帕金森病(PD)是最普遍的神经退行性疾病之一，影响2%-3%的65岁及以上人群。一般来说，PD的特征是中脑黑质中多巴胺能神经元的选择性缺失。研究人员已经报道了PD的多种分子机制，如线粒体功能障碍、氧化应激、轴突运输、Ca2+稳态和神经炎症。特别是，α-synuclein (α-Syn) （路易体的胞内成分）被认为是PD最重要的神经病理学特征之一。在PD患者的多巴胺能神经元、MPTP（四氢吡啶）处理的动物和MPP+（MPTP代谢物）处理的神经母细胞瘤细胞中观察到α-Syn的积累。此外，有研究报道，α-Syn突变(A30P、A53T和E46K)是罕见家族性PD的主要原因。
因此，清除α-Syn为帕金森病的治疗提供了一种合理的途径。自噬被认为在降解细胞内α-Syn聚集物中起着重要作用。Rapamycin（雷帕霉素）已被证明通过诱导自噬减少α-Syn聚集，从而在体内和体外保护多巴胺能神经元抵抗死亡。不幸的是，Rapamycin缺乏特异性，常常导致口腔和呼吸道感染、白细胞减少、口腔炎、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、免疫抑制等多种副作用，从而限制了Rapamycin在PD治疗中的应用。因此，目前迫切需要寻找其他能够清除α-Syn聚集物但副作用更少的PD候选治疗方法。
GM1神经节苷脂(18:1/18:0)是一种主要的脑神经节苷脂，由三个结构单元组成：一个低聚糖，一个神经酰胺锚点和几个唾液酸残基。由于其对神经元可塑性、神经营养物质的释放、神经传递以及与神经调节蛋白的相互作用的调节作用，这种分子被认为是各种大脑功能中必不可少的调节剂。外源性神经节苷脂已经被证明可以影响中枢神经系统中的多巴胺能、谷氨酸能和胆碱能神经元的存活。GM1神经节苷脂的治疗作用已在PD患者，以及MPTP治疗的小鼠和灵长类动物，显示神经保护或神经修复作用。尽管有这些积极的数据，但GM1神经节苷脂治疗PD的确切机制仍不确定。在以前的报道中，这种治疗方法被猜测以自噬依赖的方式降解α-Syn，这促使作者研究自噬是否参与GM1神经节苷脂的抗PD机制。
研究结果
1. GM1神经节苷脂改善了C57BL/6 J小鼠MPTP诱导的行为缺陷，并恢复了多巴胺及其代谢产物的水平
MPTP被酶MAO-B转化为毒性代谢物MPP+，通过抑制线粒体电子传递链复合物I杀死多巴胺能神经元。因此，MPTP和MPP+通常分别在体内和体外诱导一种与PD相似的神经元细胞毒性综合征。在本研究中，C57BL/6 J小鼠腹腔注射MPTP (30 mg/kg) 5天建立PD模型，以评估GM1神经节苷脂的保护作用。治疗2周后，进行行为测试，包括爬杆测试、旋转测试和步态分析。如（图1a）所示，MPTP处理的小鼠比对照组小鼠花更多的时间爬杆。相比之下，GM1神经节苷脂（静脉注射，25和50 mg/k）和selegiline（司来吉林MAO-B抑制剂，静脉注射，60 mg/kg）显著减少MPTP治疗的小鼠爬杆时间。在旋转测试中，MPTP处理显著降低了下降潜伏期，为MPTP所致的运动功能障碍。GM1神经节苷脂和selegiline可抑制MPTP诱导的下降潜伏期的下降（图1b）。
作者进一步评估了GM1神经节苷脂对步态的治疗作用，通过包括步速、摆动速度、步频、跑步持续时间和步行速度等参数的猫步试验。如（图1c-g）所示，MPTP处理小鼠的摆动速度和步频显著下降，而在步数周期、跑步持续时间和步行速度上，则观察到显著增加。相比而言，GM1神经节苷和selegiline的治疗有效改善了MPTP引起的这些步态行为障碍(图1c-g)。此外，GM1神经节苷治疗恢复了步态表现(图1k)。在MPTP处理的小鼠中，增加了四肢的触摸和悬挂次数(图1l)，和步法模式的数量(图1m)。这些行为测试提示GM1神经节苷脂对PD有明显的治疗作用。值得注意的是，GM1神经节苷脂在三个行为测试中的保护作用被3-MA（自噬抑制剂）逆转（图1 a-g和k-m）。这一发现表明，GM1神经节苷脂的保护作用可能与自噬有关。
此外，采用高效液相色谱-电化学检测小鼠纹状体中多巴胺及其代谢产物的水平。如（图1h-j）所示，MPTP处理显著降低了多巴胺、二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的水平。GM1神经节苷脂和selegiline治疗可防止MPTP诱导的多巴胺、DOPAC和HVA水平减少，提示GM1神经节苷脂能有效改善多巴胺能神经元的功能。
2. GM1神经节苷脂改善MPP+诱导的神经毒性，减少神经元细胞中α-Syn的积累
MPTP的代谢物MPP+在体外可导致神经毒性。因此，作者进一步利用MPP+验证GM1神经节苷脂对SH-SY5Y细胞的神经保护作用。如（图2a）所示，GM1神经节苷脂浓度小于320μM时不引起任何细胞毒性。MPP+ （1 mM）显著抑制细胞增殖，而不同浓度的GM1神经节苷脂（20、40和80 μM）处理可显著减弱MPP+诱导的细胞增殖抑制（图2b）。此外，MPP+导致细胞形态发生明显变化，伪足减少，胞体拉长，GM1神经节苷脂使其恢复（图2c）。Western blot分析显示，GM1神经节苷脂处理显著抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞钟α-Syn积累（图2d）。同样，GM1神经节苷脂以时间依赖性的方式降低了PC12α-Syn A53T细胞中的α-Syn过表达作用（图2e）。
线粒体功能缺陷和氧化应激已在PD的发病机制中得到证实。如（图2g和h）所示，1 mM MPP+处理SH-SY5Y细胞36 h后，线粒体膜电位(δ ψ m)明显降低，ROS水平升高，而GM1神经节苷脂治疗明显抑制了这些变化。此外，自噬抑制剂（3-MA或bafilomycin A1）可消除GM1神经节苷脂的治疗效果。这些体外研究结果与MPTP处理的小鼠的观察结果一致，进一步提示自噬激活参与了GM1神经节苷脂对PD的保护作用。
3. GM1神经节苷脂诱导神经元细胞自噬
已有研究报道GM1神经节苷脂可诱导促进多种细胞系自噬。体外实验显示，不同剂量的GM1神经节苷脂处理SH-SY5Y细胞后，自噬标记物LC3-II增加和自噬底物SQSTM1/p62的降解均增强，特别是在40 μM（图3a）。另外，在该剂量下，GM1神经节苷脂对细胞处理24 h后，这些自噬相关蛋白的影响最为明显（图3b）。为更直观的观察GM1神经节苷脂对细胞自噬的促进作用，作者使用mRFP-GFP-LC3标记进行自噬通量测定。Rapamycin（雷帕霉素）通过抑制mTOR发挥自噬诱导作用，作为阳性对照。由于GFP对低pH条件敏感，当自噬小体与溶酶体融合时，GFP(绿色)荧光被熄灭，只能观察到mRF（红色）荧光。当GFP和mRFP（黄色）荧光同时出现时，说明自噬小体不与溶酶体结合。与对照组相比，GM1神经节苷脂和Rapamycin处理的细胞中红色斑点明显增多，而GM1神经节苷脂和bafilomycin A1联合处理可增强黄色斑点（图3c），说明GM1神经节苷脂增强了SHSY5Y细胞的自噬通量。
4. GM1神经节苷脂激活自噬有助于清除α-Syn
由于去除异常的α-Syn为PD的治疗提供了一个很有潜力的策略，早期研究表明自噬介导的α-Syn降解有利于对PD的保护作用。GM1神经节苷脂对MPTP诱导的小鼠及MPP+诱导的细胞的保护作用被3-MA和bafilomycin A1阻断，说明可能与自噬激活有关。如预期的那样，3-MA显著消除了GM1神经节苷脂对MPP+处理SH-SY5Y细胞中α-Syn蛋白水平的影响（图4a）。作者随后进一步确定GM1神经节苷脂对自噬过程的影响。数据显示，MPP+存在下，GM1神经节苷脂处理明显促进了SH-SY5Y细胞中LC3-I向LC3-II的转化，同时自噬底物SQSTM1/p62蛋白水平下降（图4b）。此外，透射电镜显示，GM1神经节苷脂处理小鼠的黑质中存在明显的自噬泡（图4c）。重要的是，共聚焦显微镜图像显示GM1神经节苷脂诱导的自噬小体与MPP+诱导的α-Syn共定位（图4d）。这些体内和体外数据表明，GM1神经节苷脂激活自噬，参与α-Syn清除。
此外，作者使用doxycycline诱导α-Syn A53T表达的PC12α-Syn A53T细胞，验证GM1神经节苷脂对自噬和α-Syn清除的影响。共聚焦显微镜结果（图5a）显示，在PC12α-Syn A53T细胞中，GM1神经节苷脂处理后LC3斑点增加，而doxycycline诱导的α-Syn积累减少，其中LC3和α-Syn的共定位显著增强（图5a）。Western blot分析证实，GM1神经节苷脂导致α-Syn蛋白水平下降，而3-MA共处理逆转了这一趋势（图5b）。与GM1神经节苷脂类似，Rapamycin也能强烈降低α-Syn水平（图5b）。作者采用化学反应方法，用荧光FITC荧光标记GM1神经节苷脂。在受GM1-FITC处理的PC12α-Syn A53T细胞中观察到强烈的绿色荧光（图5c）。同时，在PC12α-Syn A53T细胞中，GM1-FITC和α-Syn以及GM1-FITC和LC3之间观察到明显的共定位（图5d）。综上所述，这些数据表明GM1神经节苷脂激活自噬来清除α-Syn的积累。
5. ATG13-ULK1复合物参与GM1神经节苷脂诱导的自噬
ULK复合体由ULK1、ATG13、FIP200和ATG101组成，它们是启动自噬过程所必需的。作者评估了GM1神经节苷脂对ULK1和ATG13蛋白表达水平的影响。值得注意的是，GM1神经节苷脂处理促进了PC12α-Syn A53T细胞中ATG13和ULK1的磷酸化（图6a）。然而，GM1神经节苷脂的作用被3-MA抑制（图6a）。同样，GM1神经节苷脂处理的SH-SY5Y细胞也显示出p-ATG13/ATG13的比例增加，而3-MA处理抑制了GM1神经节苷脂的这种作用（图6b）。综上所述，GM1神经节苷脂通过激活ATG13-ULK1复合物来诱导自噬。
总结
总的来说，作者通过MPTP/MPP+处理建立了α-Syn过表达模型，以评估GM1在体内和体外对PD的治疗作用。此外，使用表达诱导型α-Syn的PC12α-Syn A53T细胞来证明GM1和α-Syn之间的直接关系。研究结果表明，自噬的激活解释了GM1神经节苷脂的抗PD作用，并为GM1神经节苷脂清除α-Syn的机制提供了可能的理论基础。
安卓健和物罗凯的药理作用机制有何区别
安卓健是由台湾国鼎研发的美国FDA候选抗癌新药。安卓健是多通道多靶点分子靶向药物。一方面，安卓健通过抑制癌细胞增殖上游因子RAS激酶，从而抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路，直接从源头上抑制癌细胞的生长。同时，安卓健通过抑制原癌基因K-RAS的活性，进而影响其下游讯息传递因子，包括抑制PI3K的表现量和降低AKT（丝/苏氨酸蛋白激酶）的磷酸化程度，以及活化AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）促使TSC1、TSC2（全能干细胞）结合更加紧密，从而大大降低mTOR（雷帕霉素靶蛋白）的活性，开启癌细胞的自噬作用机制。另一方面，安卓健可以通过抑制EGFR（表皮生长因子受体）、VEGFR（血管内皮生长因子受体）、PDGFR（血小板衍生生长因子受体），抑制新生血管的形成和切断癌细胞的营养供应，达到抑制癌细胞增殖和转移的目的。
特罗凯是瑞士罗氏公司研发的单靶点靶向药物。特罗凯的药理机制主要为抑制EGFR（表皮生长因子）酪氨酸激酶胞内磷酸化。同易瑞沙类似，服用特罗凯也需要做基因检测。
雷帕霉素mTOR 抑制剂浓度
最近关于雷帕霉素的问题蛮多的；下面简单说一下它：
雷帕霉素是一种有效的特异mTOR抑制剂，在HEK293细胞中的IC 50为0.1 nM。雷帕霉素与FKBP12结合，并特异性地充当mTORC1的变构抑制剂。雷帕霉素是一种自噬激活剂，一种免疫抑制剂
雷帕霉素的体外
雷帕霉素（12.5-100 nM; 24小时）处理在所有测试的细胞系（A549，SPC-A-1、95D和NCI-H446细胞）中以剂量依赖性方式对肺癌细胞增殖产生适度的抑制作用
雷帕霉素的体内
单独使用雷帕霉素（2.0 mg / kg；腹膜内注射；隔日一次； 28天）具有中等抑制作用。然而，与对照组，雷帕霉素单药治疗组和二甲双胍单药治疗组相比
以上是关于雷帕霉素的简单的介绍和部分的生物活性的内容，希望给到你帮助···
